По 25 дена статичка инкубација на 28°C, лаказата од *Pleurotus ostreatus* NRC620 покажа највисока активност во медиумот за габична култура. Оптималните вредности на pH и температура за овој ензим беа 3,0 и 70°C, соодветно. По 2 часа инкубација на 40°C и 50°C, ензимската активност задржа 68,33% и 59,61%, соодветно. По 2 часа инкубација во цитрат-фосфатен пуфер (pH 7,0), ензимската активност остана на 100%. Додавањето на 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ ја зголеми ензимската активност за приближно 21% и 35%, соодветно, додека NaCl, MnCl₂, KCl и CaCl₂ ја инхибираа ензимската активност. Користејќи ABTS како супстрат, кинетичките параметри (Km и Vmax) на *Pleurotus ostreatus* NRC 620 лаказата беа 1,99 mM и 16.217 μmol min−1 L−1, соодветно. Ензимскиот третман на примероци од сок од јаболко значително ја намали и pH вредноста и вискозитетот, а ова намалување корелира со зголемување на времето на складирање. Третманот со лаказа резултираше со мало намалување на вкупната содржина на феноли во сокот од јаболко, но не беше забележано намалување на антиоксидантната активност.
Во последниве години, истражувачите се фокусираа на примената на зелената биотехнологија во прехранбената индустрија. Лаказата е еден од најкорисните ензими во прехранбената индустрија, наоѓајќи примена во области како што се преработка на сокови, печење, стабилизација на вино и подобрување на органолептичките квалитети на прехранбените производи.1Многу повисоки растенија и микроорганизми лачат лаказа,2и габи како што се деутеромицетите, аскомицетите и базидиомицетите исто така можат да произведат лаказа.3Лаказата (EC 1.10.3.2) е сина оксидаза која го редуцира молекуларниот кислород во вода користејќи систем кој се состои од три различни атоми на бакар, со што оксидира различни фенолни соединенија и ароматични амини. За време на производството на овошни и зеленчукови сокови, ензимското и неензимското кафеаво потемнување се критични проблеми.4Бидејќи овие супстанции негативно влијаат на бојата, вкусот и аромата на сокот, тие мора да се отстранат.5
Од сите овошја, јаболката се најконзумирани во светот и во Европската Унија. Во 2019 година, производството на јаболка се рангираше на третото место во светот, надминувајќи 87 милиони тони.6Јаболката содржат бројни фенолни соединенија, вклучувајќи флавоноиди и фенолни киселини како што се кофеинска киселина и хлорогенова киселина.7Бидејќи сокот од јаболко обично се консумира во бистра форма, приближно 50% до 90% од фенолните компоненти се губат за време на процесот на филтрација.8Денес, потрошувачите имаат тенденција да избираат минимално преработени производи, како што е заматениот сок од јаболка со висока содржина на полифеноли. Сепак, поради високата содржина на феноли, овој вид сок од јаболка е особено подложен на промена на бојата и потемнување.9Различни технологии, вклучувајќи методи на термичка обработка како што е пастеризација на 60–90°C, се користат за намалување или спречување на потемнување на сокот од јаболко.10Сепак, според истражувањето на Sauceda-Gálvez11, термичката обработка може да ги уништи испарливите хемикалии и да влијае на органолептичките квалитети на сокот од јаболко. Алтернативи на методите за термичка обработка вклучуваат суперкритичен јаглерод диоксид, ултравиолетово зрачење, ултразвук, висок хидростатски притисок или хомогенизација под висок притисок.12Ефикасноста на овие технологии и приносот на соодветни овошни сокови зависат од употребените параметри и карактеристиките на производот. Нивната широка употреба е ограничена од високите трошоци, негативните ефекти врз квалитетот на некои прехранбени производи или несоодветната ензимска инактивација.13,14
Лаказата може да се користи за стабилизирање и бистрење на овошниот сок.15Гокмен и др.16препорачуваат употреба на лаказа за бистрење на овошен сок бидејќи ефикасно ги отстранува фенолните соединенија со нивно претворање во полимери или олигомери кои лесно се отстрануваат со која било ултрафилтрациска мембрана, овозможувајќи сокот од јаболко да одржува стабилна боја и бистрина до шест недели на 50°C. Прочистената *Trichoderma* лаказа беше имобилизирана на алумина зрна и беше употребена за селективно отстранување на соединенијата со непријатен вкус предизвикани од микробна контаминација на сокот од јаболко.17
Приближно 80-90% од испарливите компоненти на сокот од јаболко се естри и алдехиди, кои му даваат уникатна арома на сокот.18Лакасата од *Trametes versicolor* беше имобилизирана на евтина подлога направена од природни влакна од млади кокосови лушпи за бистрење на сокот од јаболко.19Претходни студии ја испитуваа стабилизацијата на сокот од јаболко (боја и заматеност) користејќи методи без ензими или методи на имобилизација, или во комбинација со ултрафилтрација.5,19Сепак, ефектот на габичните лакази врз физичко-хемиските својства на сокот од јаболко за време на складирањето останува нејасен. Затоа, целта на оваа студија беше експериментално да се испитаат промените во физичко-хемиските својства, содржината на фенолни соединенија и антиоксидантната активност на сокот од јаболко по третманот со габични лакази и двонеделно складирање во фрижидер. Лаказите имаат способност да оксидираат фенолни соединенија, што ги прави ветувачки за употреба во различни индустриски процеси, вклучително и бистрење на сокот. Оваа студија ги испитуваше лаказите од *Pleurotus ostreatus* NRC 620, фокусирајќи се на идеалните услови за нивната активност и ефикасност во бистрењето на сокот. Иако истражувањето за печурките остриги (P. ostreatus NRC 620) е сè уште ограничено, претходните студии испитуваа ензими од различни габични извори, како што се Trametes versicolor и Ganoderma lucidum. Целта на оваа студија беше да се процени потенцијалната примена на овој ензим во прехранбената индустрија и да се истакнат неговите уникатни својства, особено неговата идеална pH вредност и температура.
2,2′-азооксибис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонска киселина) (ABTS) беше купен од Sigma-Aldrich (Канада). Сите други реагенси беа со аналитичка чистота.
Центарот за собирање микробиолошки култури на Националниот истражувачки центар го доби познатиот сој на остриги печурки NRC620. По субкултивирањето, овој сој беше складиран на коси агар од компиров декстроза на 4°C. Методот за подготовка на инокулумот беше следниов: 10-дневен, целосно развиен мицелиум беше инокулиран на плочи од компиров декстроза агар и инкубиран на 28°C. По 10 дена, три мицелијални блокови со дијаметар од 12 mm беа отстранети од агарската подлога со стерилен метален перфоратор и поставени во Ерленмаерови колби од 250 mL со памучни чепови што содржат 50 mL стерилизирана културна подлога (pH 5,0, како што е претходно опишано од Отман и сор.20). Културите беа инкубирани на 28°C во тек на 18 дена. Потоа културите беа филтрирани низ филтер-хартија Whatman бр. 1, а добиениот супернатант послужи како извор на ензими.
Активноста на лаказата беше определена со користење на ABTS како супстрат. Реакционата смеса (2 mL) содржеше 500 μL 0,3 mM ABTS (растворен во 0,1 M натриум цитрат пуфер, pH 4,5) и потребната количина на ензимски примерок разреден со дестилирана вода.21,22Со оглед на тоа што лаказата може да оксидира ABTS на собна температура (28 °C ± 2), оксидацијата на ABTS беше определена со мерење на зголемувањето на апсорпцијата на 420 nm (ε420= 36.000 см-1 M -1) користејќи Agilent Carry-100 UV спектрофотометар. Една единица лаказна активност беше потребна за оксидирање на 1 μmol ABTS во минута. Концентрацијата на протеини беше определена со методот Брадфорд користејќи говедски серумски албумин како внатрешна контрола.23,24
По добивањето на ензимот од сојот на печурка остриги NRC 620, неговата активност беше мерена во различни интервали на одгледување во тек на 25 дена под статички услови на 28 °C.
За да се проучи ефектот на температурата врз активноста на лаказата, експериментите беа спроведени во температурен опсег од 20 до 90 °C. Пред додавањето на ензимот и започнувањето на реакцијата, пуферот (0,1 M натриум цитрат, pH 4,5) и супстратот (ABTS) беа измешани и инкубирани 5 минути на различни температури. Термичката стабилност на ензимот беше оценета со инкубација во 0,05 M натриум фосфатен пуфер (pH 7,0) на 40, 50, 60 и 70 °C во тек на 2 часа, соодветно. Резидуалната активност потоа беше оценета со користење на ABTS супстратот.
Ефектот на pH вредноста врз активноста на лаказата беше оценет со користење на ABTS како супстрат во 0,1 M цитрат-фосфатни пуфери со pH опсег од 2,5 до 7,0. Ензимскиот раствор беше инкубиран на 40°C два часа во 0,1 M цитрат и Tris пуфери (pH 3, 4, 6 и 7) за да се процени стабилноста на pH вредноста. Резидуалната активност со ABTS како супстрат беше пресметана по инкубацијата.
Лаказата беше инкубирана 10 минути во натриум фосфатен пуфер (0,05 M, pH 7,0) што содржи различни метални јони (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ и Mn2+) во концентрации од 2,5 mM и 10 mM, соодветно. Потоа беше додаден супстратот (ABTS) за да се иницира реакцијата, а релативната активност беше оценета.
Оксидацијата на ABTS од лаказа при различни концентрации (0,025–3 mM) беше измерена при pH 4,5 за да се утврдат кинетичките параметри (Vmax и Km). Кинетичкитеконстантиод равенката Михаелис-Ментен беа пресметани со помош на дијаграмот Lineweaver-Burk, кој ја прикажува реципрочната вредност на брзината на реакција како функција од концентрацијата на супстратот. Кинетичките константи беа пресметани од дијаграмот Lineweaver-Burk со помош на софтверот GraphPad Prism верзија 6.01.
Откако јаболката темелно се измија со вода од чешма, тие беа преполовени и исцедени со целосно автоматски соковник за јаболка Braun MP80 (произведен во Германија). Сокот беше филтриран низ четири слоја газа. Во контролната група не беа додадени ензими, додека 2,0% лаказа (тестираната најефикасна концентрација) беше додадена во свежо подготвениот сок од јаболка, кој потоа беше чуван на 4°C две недели.
Титратираната киселост (TA) и pH беа определени според методот на Бултон иал.27pH вредноста на секој примерок беше измерена со помош на дигитален pH метар (pH метар JENWAY 3510). Титрираната киселост (TA) беше пресметана врз основа на јаболкова киселина со помош на следната формула.
Каде што V и C се волуменот (mL) и концентрацијата (0,1 mol/L) на растворот на натриум хидроксид што се користи во титрацијата, соодветно. K е коефициентот на конверзија на јаболкова киселина, еднаков на 0,067, а W е масата (g) на сокот од јаболко.
Вкупно растворливи цврсти материи (TDS) содржината на сите примероци од сок беше одредена со помош на џебен рефрактометар PAL-1 (ATAGO, Токио, Јапонија). По секое мерење, оптичката леќа беше исплакната со дејонизирана вода, а секој примерок од сок од јаболко беше тестиран три пати. Вредноста за секој примерок беше пресметана со пресметување на просекот од трите мерења. Средната вредност ± стандардна девијација за секој примерок од сок од јаболко беше исто така пресметана со пресметување на просекот од овие резултати.
Вискоеластичноста на примероците од сок од јаболко беше оценета со помош на ротационен вискозиметар (RV, Rheotest 2, Германија). Примерокот беше ставен во цилиндарот „S2“ на вискозиметарот. Очигледната вискозност беше претставена со наклонот на кривата на смолкнување наспроти брзината на смолкнување, која беше пресметана од напонот на смолкнување и соодветните криви при различни брзини на смолкнување (од 1,00 до 437,4 s⁻¹). Формулата за пресметување на очигледната вискозност е како што следува:
Каде што η е очигледна вискозност (cP), τ е напрегањето на смолкнување (dyn/cm²), γ е брзината на смолкнување (sec⁻¹), а (τ) се пресметува со користење на вредностите на вртежниот момент (α) и цилиндарот (Z) со користење на следната формула: τ = Z . α.
Индексот на кафеава боја беше определен според методот на Меидав иал.29Примерок од сок од 10 ml беше центрифугиран на 2750 xg во тек на 10 минути. 5 ml од супернатантот на сокот беше измешан со 5 ml 95% етанол. Апсорпцијата на смесата беше измерена на 420 nm со помош на Shimadzu UV спектрофотометар (UV-1601 PC).
Вкупната содржина на феноли (TPC) беше определена колориметриски со користење на реагенсот Фолин-Чиокалтеу како што е опишано од Бултон и сор.[27]]. Стандардна крива на гална киселина беше конструирана за концентрации од 0 до 500 mg/L (r²= 0,997). Резултатите се изразуваат како еквиваленти на гална киселина (mg GAE/mL).
Додадете 125 μL дестилирана вода и 2850 μL раствор од FRAP во 25 μL сок од јаболко и оставете ја смесата на темно место.30мин. Потоа измерете ја апсорпцијата на 593 nm користејќи Shimadzu UV спектрофотометар (UV-1601 PC). Реагенсот FRAP беше подготвен со мешање на 300 mM ацетатен пуфер (pH 3,6), 20 mM железо(III) хлорид и 10 mM 2,4,6-трис(2-пиридил)триазин (TPTZ) (растворен во 40 mM HCl) во сооднос 10:1:1. Стандардна крива беше генерирана користејќи Trolox како стандард (R²= 0,999), а резултатите се изразени како μM Тролокс/мл.
Антиоксидантната активност на третираните и нетретираните сокови беше определена со користење на DPPH методот за да се процени нивната способност да ги отстранат слободните радикали на DPPH.31Десет микролитри сок беа измешани со 1 ml раствор на DPPH (100 μM) во метанол. По реакцијата во темница во траење од 30 минути, апсорпцијата на смесата беше измерена на 517 nm со помош на Shimadzu UV спектрофотометар (UV-1601 PC). Резултатите беа изразени како тролокс еквиваленти (μM тролокс/ml) врз основа на калибрациска крива (R2= 0,990).
Добиените податоци покажаа дека максимално производство на лаказа е забележано кај печурките од видот NRC 620 до крајот на 18-тиот ден од ферментацијата, достигнувајќи активност од 1302 U/L. Ова послужи како основа за одредување на оптималното време на одгледување за производство на лаказа (Слика 1). Иако производството на ензими се зголемуваше со зголемување на времето на одгледување, стапката на зголемување не беше директно пропорционална на времето на одгледување; по 21 ден, ензимската активност се зголеми само за 90 U/L (на 1390 U/L). Затоа, 18 дена беа на крајот избрани како оптимално време на одгледување за да се избалансира приносот на производот со економските придобивки од зголеменото време на одгледување.
Влијание на времето на култивирање врз приносот на лаказа кај Pleurotus ostreatus NRC 620. Три (12 mm) мицелијални блокови од габи беа инокулирани во 50 ml стерилен медиум, а потоа култивирани на 28 °C во различно време.
Во согласност со други студии, нашите резултати покажуваат дека идеалниот период на култивирање за постигнување на врвна секреција на лаказа од страна на габите веројатно е помеѓу 7 и 36 дена.32Според Езике и др.33, *Trametes polyzona* WRF03 произведе најголема количина на лаказа до крајот на деветтиот ден од ферментацијата, со специфична активност од 1637 U/mg протеин. Понатаму, Отман и сор.34откриле дека *Trichoderma harzianum* S7113 лачила голема количина на лаказа на петтиот ден од културата. Стапката на производство на лаказа достигнала врвна активност на четиринаесеттиот ден, а потоа постепено се намалила.34Иако лачењето на ензими може да се случи и за време на главната фаза на раст, тоа обично достигнува врв за време на средната фаза и е предизвикано од потрошувачката на извор на јаглерод или азот.34,35
Иако лаказата од Pleurotus ostreatus NRC 620 покажала висока активност во широк температурен опсег од 50°C до 80°C, приближувајќи се до врвна активност (69–98%), нејзината максимална активност е забележана на 70°C (сл. 2а). Надвор од овој температурен опсег, ензимската активност се намалила на приближно 70°C. Овие резултати сугерираат дека ензимот е активен на високи температури, веројатно затоа што високата температура ја зголемува кинетичката енергија на реакцијата.
Влијание на температурата на реакцијата (а) и pH вредноста (б) врз активноста на лаказата кај *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Температурите во опсег од 20 до 90 °C беа постигнати со претходно инкубирање на смесата на различни температури во тек на 5 минути пред додавање на ензимот и започнување на реакцијата. Влијанието на pH вредноста врз активноста на лаказата беше оценето со користење на ABTS како супстрат во раствори што содржат 0,1 M цитрат-фосфатен пуфер во опсег на pH од 2,5 до 7,0.
Според Езике иал.33, оптималната температура за лаказата *Trametes polyzona* WRF03 е 55 °C, што е иста како и за *Ganoderma lucidum*лакаса36и слична на оптималната температура (50 °C) за *Trametes polyzona* KU-RNW02737лаказа . Балдријан38забележува дека, како и за другите ензимски системи што го разградуваат лигнинот, идеалниот температурен опсег за лаказата е помеѓу 50 и 70 °C.
Резултатите покажаа дека ензимот покажал највисока активност при pH 3,0, достигнувајќи 94% активност при pH 3,5. Сепак, тој останал активен во широк pH опсег од 2,5 до 7,0 (Слика 2б). Понатаму, тој покажал поголема активност во кисели услови во споредба со неутрални или алкални услови. Неговата активност останала најмалку 77% во pH опсегот од 2,5 до 4,5, но достигнала само приближно 38% при pH 7,0. Оптималната pH вредност за лаказата од *Trametes polyzona* WRF03 била 4,533, што е исто како и pH вредноста за лакази од *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 и *Trametes hirsuta* 41. Сепак, според студијата на Chairin et al.42, оптималната pH вредност за лаказа од *Polymorpha f. sp.* WR710-1 е 2,2, додека оптималната pH вредност за лаказа од *Polymorpha f. sp.* IBL-04 е 5,043. Врзувањето на хидроксидни анјони (инхибитор на лаказа) за атомите на бакар на T2/T3 лаказата може да биде причина за намалената активност на лаказата под неутрални или алкални pH услови. Ова може да го наруши внатрешниот пренос на електрони од центарот T1 до центарот T2/T3, со штоограничувачкиензимската активност23,44
Со инкубирање на ензимот на различни температури, беше откриено дека и времето на инкубација и температурата влијаат врз стабилноста на ензимот. Имено, лаказата од *Trametes polyzona* NRC 620 покажа поголема стабилност на 40℃ и 50℃, задржувајќи 68,33% и 59,61% од својата почетна активност, соодветно, по 120 минути (Слика 3а). Спротивно на тоа, под истите услови (40℃ и 50℃, 120 минути), лаказата од *Trametes polyzona* WRF03 задржа 64,38% и 42,92% од својата активност, соодветно.33Напротив, зголемувањето на времето на инкубација и температурата ја намалија стабилноста на лаказата *Trametes polyzona* NRC 620; По инкубација на 60℃ и 70℃ во тек на 60 минути, нејзината активност се намали на 39,24% и 1,72%, соодветно (Слика 3а). Во согласност со експерименталните резултати, лаказата од *Trametes polyzona* WRF03 покажа поголема стабилност на 40 и 50℃ во текот на целиот процес на термичка обработка.33Слично на тоа, Луеанџароенкит иал.37и Чаирин иал.42ја објавија стабилноста на лакасите од Trametes polyzona KURNW027 и Trametes polyzona WR710-1 на 50 °C во тек на 1 час, соодветно. Како корисен биокатализатор применлив во различни биотехнолошки области, лаказата треба да има добра стабилност и перформанси во широк температурен опсег.
Термостатска стабилност (а) и pH стабилност (б) на лаказа од *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Термостатската стабилност беше оценета со инкубирање на ензимскиот раствор во 0,05 M натриум фосфатен пуфер (pH 7,0) на 40, 50, 60 и 70 °C во тек на 2 часа, соодветно. pH стабилноста беше оценета со инкубирање на ензимскиот раствор во 0,1 M цитратен пуфер и Tris пуфер (pH 3, 4, 6 и 7) на 40 °C во тек на 2 часа. Резидуалната активност беше пресметана со користење на ABTS како супстрат по инкубацијата.
За да ги одредиме оптималните услови за употреба и складирање на ензимите, го испитавме ефектот на pH вредноста врз стабилноста на лаказата. Изложеноста на различни pH вредности значително влијаеше врз стабилноста на протеинската структура, со што влијаеше врз стабилноста и активноста на молекулата на ензимот. Резултатите покажаа дека ензимот е помалку стабилен во кисели услови, додека покажува подобра стабилност при повисоки pH вредности (неутрални и алкални региони). При pH вредности од 7,0, 6,0, 4,0 и 3,0, стапките на задржување на ензимот по 120 минути беа приближно 100%, 62,54%, 52,39% и 11,14%, соодветно (Сл. 3б). *Strombus multisus* WRF03 лаказата покажа поголема стабилност при неутрални pH вредности (5,5–6,5) и помала стабилност при кисели pH вредности (под 4,0). По 120 минути при pH вредности од 5,5, 6,0 и 6,5, стапките на задржување на ензимите беа приближно 82%, 100% и 93%, соодветно.33Хаирин и др.42забележале дека лаказата од Trametes polyzona WR710-1 била стабилна во pH опсег од 6,0 до 7,0, додека Сајед и сор.45покажа дека лаказата е постабилна под неутрални pH услови. Сепак, лаказата од Cerrena unicolor, исто така, покажа стабилност под алкални услови (pH 9,0)46Испитуваните лакази покажаа висока стабилност во широк опсег на pH вредности. Ова може да биде важна карактеристика за индустриски апликации.
Бидејќи некои метални јони имаат и стимулативни и инхибиторни ефекти врз ензимската активност, нивните ефекти врз ензимската активност мора да се земат предвид во индустриските апликации. Ова е клучно бидејќи металните јони се чести загадувачи на животната средина кои можат да влијаат на стабилноста и синтезата на екстрацелуларните ензими.47За да ги испитаме ефектите на повеќе метални јони врз лаказата од *Pleurotus ostreatus* NRC 620, спроведовме соодветни експерименти. Како што е прикажано на Слика 4, во зависност од видот на употребениот метал, зголемувањето на концентрацијата на метални јони од 2,5 mM на 10 mM негативно влијаеше врз функцијата на ензимот. На пример,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, иCu²⁺може да ја стимулира и активира ензимската активност, додекаNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, иК⁺може да ја инхибира ензимската активност. При концентрација од 10 mM, јоните Cu²⁺ и Mg²⁺ беа најмоќните активатори на лаказната активност од *Pleurotus ostreatus* NRC 620, обезбедувајќи степен на активирање од приближно 34% и 20%, соодветно. Сепак, при концентрација од 10 mM, јоните Ca²⁺ беа најмоќниот инхибитор на лаказата, намалувајќи ја ензимската активност за приближно 60%.
Влијанието на металните јони врз активноста на лаказата Pleurotus ostreatus NRC 620. Лаказата беше инкубирана 10 минути во натриум фосфатен пуфер (0,05 M, pH 7,0) што содржи различни метални јони во концентрации од 2,5 mM и 10 mM. Реакцијата потоа беше иницирана со додавање на подлогата (ABTS), по што беше измерена релативната активност.
Нашите резултати се во согласност со оние на други автори кои откриле дека Mg²⁺ и Cu²⁺ ја зголемуваат активноста на *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ откриле дека лаказата од *Xylaria* sp. е стимулирана до одреден степен од јони на бакар (Cu²⁺). Понатаму, Foroutanfar et al.⁴⁹ и Si et al.⁵⁰ спровеле слични студии за лакази од *Paraconiothyrium variabile* и *Trametes pubescens*, соодветно. Местото за врзување на бакар тип II (T2) на овој ензим може да биде заситено со Cu²⁺ при дадена концентрација, што може да го објасни стимулирањето на активноста на лаказата при повисоки концентрации на Cu²⁺⁹. Бидејќи лаказите кај габите од бело гниење се оксидази што содржат повеќе атоми на бакар, ефектите на јоните на бакар врз активноста на лаказата се разновидни и се движат од стимулативни и инхибиторни до неутрални.⁵¹ Спротивно на тоа, Zhou et al.. [52]објави декаCu²⁺ја инхибирале лаказната активност на тајванскиот подземен термит (Odontotermes formosanus). Сепак, лаказите на Cerena sp. HYB07[53]и Clitocybe maxima[54]не беа погодени од бакарни јони.
Специфичноста на супстратот беше претставена со неговите кинетички параметри (Km и Vmax); колку е посилен афинитетот на врзување на супстратот за ензимот, толку е помала вредноста на Km и толку е поголема специфичноста на супстратот.3,21,55Кинетичките параметри (Km и Vmax) на лаказата од *Pleurotus ostreatus* NRC 620 беа одредени со користење на софтверот GraphPad Prism 6.0 со прикажување на графиконот Lineweaver-Burk (Слика 5). При користење на ABTS како супстрат, резултатите беа 1,99 mM и 16217 μmol.мин⁻¹ L⁻¹,соодветно. Елсајед и др.21објавија дека вредностите на Km за оксидација на ABTS биле 0,1 mM и 0,064 mM, соодветно, што укажува на висок афинитет на изоензимите Lac A и Lac B за ABTS. Понатаму, вредностите на Vmax биле 0,182 μmol.мин⁻¹и 0,603 μmolмин⁻¹, соодветно. Добиената вредност на Km беше пониска од онаа на Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); понатаму, нивната Vmax вредност (1429 mmol min⁻¹) беше исто такапонизоккога се користи ABTS како супстрат.33 Слично, вредностите на Km на концентрациите на лаказа кај Lentinus squarrosulus MR13 и Trametes sp. AH28-2 беа 0,0714 mM и 0,025 mM, соодветно, а вредностите на Vmax беа 0,0091 mM min−1 и 0,67 mM min−1 mg−1 (во однос на ABTS), соодветно.56,57
Истражен е ефектот на концентрацијата на ABTS врз активноста на лаказата од *Pleurotus ostreatus* NRC 620, и е претставен Lineweaver-Burk графикон на реципрочната вредност на почетната брзина на реакцијата наспроти концентрацијата на ABTS. Реакцијата на оксидација на ABTS со различни концентрации (0,025–3,0 mM) на лаказа е измерена при pH 4,5 за да се утврдат кинетичките параметри (Vmax и Km). Кинетичките константи на Michaelis-Menten се пресметани со користење на Lineweaver-Burk графикон на реципрочната вредност на брзината на реакцијата наспроти концентрацијата на супстратот. Кинетичките константи се пресметани од Lineweaver-Burk графиконот со користење на софтверот GraphPad Prism 6.01.
Традиционалните ензими за прочистување, како што се пектиназите, ги хидролизираат пектинските супстанции, намалувајќи ја вискозноста и заматеноста. Тие ефикасно ги разградуваат структурните полисахариди и често се користат во комбинација со други ензими, како што се целулазите и хемицелулазите, за да се подобри приносот и бистрината. Сепак, пектиназите не се насочени конкретно кон фенолните соединенија, кои се главните причинители за заматеноста и оксидативното кафеаво потемнување, особено во сокови како што се сокот од јаболко и грозје.58Спротивно на тоа, лакасите катализираат оксидација на фенолните соединенија, полимеризирајќи ги во поголеми, нерастворливи молекули кои можат да се отстранат со седиментација или филтрација. Овој механизам не само што ја подобрува бистрината, туку и го продолжува рокот на траење на сокот со намалување на веројатноста за оксидативно потемнување предизвикано од фенолните соединенија. Понатаму, процесите на бистрење базирани на лаказа може да се извршат под благи услови на преработка (pH 3,5–5,5, температура 25–40 °C), што ги прави погодни за деликатни сокови без да се нарушат нивните нутритивни или органолептички својства.59Студиите покажаа дека третманот со пектиназа може да го прочисти сокот за 1-2 часа, додека третманот со лаказа обично бара подолго време на реакција (3-6 часа) за целосно да се редуцираат фенолните соединенија. Сепак, овој процес може да се оптимизира со имобилизација на ензимот или со комбинирање на лаказата со методи на механичко прочистување.60Во оваа студија, ензимското профилирање на суровиот екстракт откри значајни активности на лаказа и α-амилаза, додека активностите на пектиназа и ксиланаза беа екстремно ниски, а активноста на целулаза не беше откриена. Затоа, намалувањето на заматеноста и содржината на феноли главно се должеше на дејството на лаказата, додека промената на вискозитетот може делумно да се должи на дејството на амилазата.
Табела 1 ги прикажува физичко-хемиските параметри на свежо исцедениот сок од јаболка и примероците третирани со лаказа. Резултатите покажаа дека приносот на свежо исцедениот сок од јаболка (71,59%) е помал од оној на примероците третирани со лаказа (87,34%). Овие резултати се во согласност со наодите на Пилник и Оринџ.61, кои посочија дека употребата на ензими во преработката на овошје може да го зголеми приносот на сок, да ја подобри филтрацијата и да добие висококвалитетен, бистар сок за концентрација. Зголемувањето на приносот на сок главно се должи на зголемувањето на содржината на растворливи шеќери во сокот. За време на ензимската хидролиза на овошјето, мезоглеата и пектинот во клеточните ѕидови на производот се уништуваат и се претвораат во растворливи супстанции како што се неутрални шеќери и киселини.62.pH вредноста на сокот од јаболко третиран со ензими беше значително пониска од онаа на контролната група (P < 0,05), а pH вредноста на обете групи значително се зголеми за време на складирањето (Табела 1). Овие резултати се во согласност со оние на Марк и сор.63, кој забележал дека pH вредноста на сокот од индиски ореви се намалува по складирањето по термичката обработка. Деградацијата на пектинот и формирањето на галактуронска киселина по третманот со ензими може да бидат одговорни за зголемувањето на pH вредноста за време на складирањето. pH вредноста на примероците третирани со ензими останала помеѓу 4,05 и 4,31 во текот на целото складирање, додека pH вредноста на нетретираниот сок од јаболка се движела помеѓу 4,12 и 4,33.
Вкупната киселост (TA) и на нетретираните и на третираните со лаказа примероци покажа тренд на намалување со зголемување на времето на складирање (Табела 1). Намалувањето на киселоста се припишува на конверзијата на органските киселини во јаглехидрати или ензимски реакции, како и на оксидацијата за време на складирањето на сокот.64Вкупната киселост на контролниот сок од јаболко и примероците третирани со ензими беше пониска од онаа на другите сокови (сок од јагоди 0,9%, сок од сливи 2,2%, сок од кумкват 1,0%, сок од кајсии 2,4%, сок од портокал 0,8%), но слична на онаа на другите сокови (на пр., сок од круша 0,3%).62Овие разлики кај нетретираниот свежо исцеден сок од јаболка може да се должат на различни фактори како што се условите на одгледување, генетските фактори, нивото на зрелост и методите на преработка.65Намалувањето на вкупната киселост на контролниот и сокот од јаболко третиран со лаказа е во согласност со резултатите презентирани од Сингх и сор.66во врска со намалувањето на вкупната киселост на сокот од јаболко Jin Nuo по 74 дена складирање. Од друга страна, Oshmiansky и Wojdylo67не откриле никакви значајни промени во киселоста на сокот од јаболко при проучувањето на ефектот на традиционалните методи на бистрење.
Резултатите презентирани во Табела 1 покажуваат дека вредноста на вкупните растворливи цврсти материи (TSS) во сокот од јаболко третиран со лаказа била поголема од онаа на нетретираниот примерок. Овие резултати се во согласност со објавените студии.. 68Понатаму, Табела 1 покажува дека вредноста на TSS кај контролната група со сок од јаболко била 9,58 во почетната временска точка и достигнала 11,05 до крајот на периодот на складирање. Овие вредности се пониски од вредностите на TSS кај свеж сок од јаболко објавени од Хамид и сор.. 69(11,2 и 11,80, соодветно). Вредноста на TSS на примероците од сок од јаболко третиран со лаказа значително се зголеми, почнувајќи од 11,23 и достигнувајќи 12,93 по две недели складирање на 4°C (Табела 1). Слично зголемување на TSS за време на складирањето е забележано и кај агрумите, лимоните и слатките портокали. Зголемувањето на вкупните растворливи цврсти материи (TSS) за време на складирањето може да се должи на хидролизата на полисахаридите (скроб) во моносахариди (шеќери), зголемувањето на концентрацијата поради дехидрација на сокот и разградувањето на пектинот во сокот во растворливи цврсти материи. Зголемувањето на вкупните растворливи цврсти материи (TSS) веројатно се должи на зголемувањето на растворливите шеќери, кои може да се формираат со конверзија на пектин или целулоза во растворливи шеќери од страна на пектин или целулаза, соодветно, или со хидролиза на скроб во шеќери, како што е објавено од Хамед и сор.69.Ефектот на лаказата врз својствата на сокот од јаболко може да се набљудува визуелно, бидејќи сокот од јаболко третиран со лаказа покажува подобра проточност и помал вискозитет од нетретираниот сок. Ова набљудување е евидентирано во Табела 1; Вискозитетот на примерокот третиран со ензими бил 1,87 cP, додека вискозитетот на контролниот примерок бил 2,95 cP. Ова значително намалување на вискозитетот веројатно се должи на поголемиот капацитет за задржување на вода на супстанциите слични на пектин и формирањето на кохезивна мрежна структура.
Во оваа студија, ефектот на лаказата врз индексот на кафеавост (BI) на сокот од јаболко беше испитан со мерење на апсорпцијата на 420 nm со помош на спектрофотометар. Резултатите се прикажани во Табела 1. За време на складирањето, BI на примероците од сок од јаболко и во третираните и во нетретираните групи покажа тренд на постепено зголемување. BI го одразува степенот на кафеавост и може да послужи каковажениндикатор за ензимски и неензимски реакции на кафеаво затемнување. Апсорпцијата значително се зголеми за време на складирањето (P < 0,05). На крајот од складирањето,А420Вредноста на примероците од сок од јаболко во контролната и ензимски третираната група се зголеми за околу 217% и 121%, соодветно (Табела 1). Резултатите покажуваат дека ензимскиот третман може ефикасно да го намали степенот на кафеаво потемнување за околу 56%. Резултатите од Безера и сор.[19]] се во согласност со нашите резултати; Тие користеле лаказа-глутаралдехид-кокосови влакна за да го прочистат сокот од јаболко, намалувајќи ја неговата оригинална боја за 61%.
Иако полифенолите во овошните сокови имаат позитивни хранливи и терапевтски ефекти врз човечкото тело, тие исто така можат да реагираат со протеините, предизвикувајќи заматеност, седиментација или заматеност на сокот, со што се менува вкусот и аромата на производот и се намалува неговиот рок на траење.71Целта на ова истражување беше безбедно да се намали содржината на фенолни соединенија во сокот од јаболко со употреба на лаказа од Pleurotus ostreatus NRC 620. Резултатите презентирани во Табела 1 покажуваат дека вкупната содржина на фенолни соединенија во сокот од јаболко третиран со лаказа е значително намалена пред складирањето на 4 °C. Понатаму, вкупната содржина на фенолни соединенија, исто така, се намалила за време на складирањето во двата проучувани примероци (Табела 1). Истражување од Сандри и сор.72покажа дека сокот од јаболко третиран со ензими може да ја задржи својата антиоксидантна активност и содржината на фенолни соединенија. Сепак, резултатите од студијата на Летера и др.73покажуваат дека третманот на сок од портокал со габична лаказа може да ја намали содржината на фенолни соединенија во него до 45%.
Фенолните соединенија покажаа својства како што се чистење на слободни радикали, редукција и гаснење на синглетниот кислород, трансфер на водородни атоми и донација на електрони на слободни радикали, што ги прави моќни антиоксиданси.74Затоа, во оваа студија, методите базирани на DPPH и FRAP беа користени за да се процени ефектот на лаказата врз антиоксидантната активност на сокот од јаболко складиран во фрижидер 14 дена (Табела 2). И двата методи покажаа зголемување на антиоксидантната активност за време на складирањето, што може да се должи на зголемувањето на слободните фенолни соединенија или формирањето на производи на Маилардова реакција (MRP), при што производите на Маилардова реакција веројатно се причина за зголемувањето на антиоксидантната активност.75Неензимските реакции на кафеавење (вклучувајќи ја деградацијата на аскорбинска киселина, Маиларовите реакции и киселински катализираната деградација на шеќери) произведуваат кафеави пигменти (меланоидини). Средните производи за деградација на аскорбинска киселина и производите за деградација на шеќер (како што се карбонилните соединенија) можат да реагираат со аминокиселини преку Маиларовите реакции.76Иако потемнувањето на овошјето и зеленчукот за време на складирањето е опширно проучувано, нашето разбирање за овие реакции останува ограничено.77Во споредба со FRAP методот, сокот од јаболко третиран со лаказа покажа значително помала антиоксидантна активност со DPPH методот (Табела 2), а антиоксидантната активност на сите примероци значително се зголеми со зголемување на времето на складирање. Во оваа студија беа користени два различни методи за одредување на антиоксидантната активност бидејќи нивните принципи се разликуваат. DPPH методот ја мери способноста за неутрализирање на слободните радикали, додека FRAP методот ја мери способноста за намалување на железните јони. Затоа, се препорачува да се користат повеќе методи за одредување на антиоксидантната активност за подобро разбирање на антиоксидантната активност на проучуваните примероци.78
Едно од клучните откритија на оваа студија е дека лаказата *Pleurotus ostreatus* NRC 620 покажува оптимална активност на 70°C и pH 3,0. Во споредба со другите габични лакази кои најчесто се користат за бистрење на сок, како што се лаказите *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 покажува повисока термичка стабилност и покисела pH вредност. Лаказите од *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum* обично покажуваат оптимална активност во опсег од 50-60°C и при pH вредности помеѓу 3,5 и 5,0. Оваа разлика може да придонесе за подобрена ефикасност на бистрење на сокот, особено за кисели сокови каде што стабилноста при пониски pH вредности е клучна. Уникатната карактеристика на *P. Во споредба со другите проучувани габични лакази, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 покажува способност ефикасно да функционира под попредизвикувачки услови. Неговата повисока оптимална температура на активност укажува на потенцијални предности во индустриските апликации, како што се побрзи стапки на реакција и намалена микробна контаминација. Неговата ниска pH вредност, која е добро прилагодена на киселата природа на многу сокови, може да биде корисна во процесите на бистрење на сокот. Овие резултати оправдуваат понатамошно истражување за примена во голем обем, што го прави *Pleurotus ostreatus* NRC 620 одржлива алтернатива на традиционалните извори на габична лаказа. Во споредба со претходните студии, откривме дека оптималната температура е 60°C, а оптималната pH вредност е 3,0. По реакција на 60°C во тек на 80 минути, *Ganoderma lucidum* лаказата се задржала.46% од неговата активност.79 Според Курнијавати и Нисел80Ензимите *Ganoderma lucidum* покажуваат одлична до умерена стабилност на 25°C и pH вредности кои се движат од 5,0 до 8,0, како и стабилност на pH 6,0 и температури кои се движат од 10 до 30°C. Во оваа студија, откривме дека оптималната pH вредност и температура за ензимска активност за *Pleurotus ostreatus* беа 3,0 и 70°C, соодветно. По инкубација на 40°C и 50°C во тек на два часа, ензимот задржа 68,33% и 59,61% од својата активност, соодветно. Понатаму, Pleurotus ostreatus NRC 620 лаказата покажа висока активност во широк температурен опсег од 50°C до 80°C, речиси достигнувајќи максимална активност (69%–98%), при што максималната активност беше забележана на 70°C.
Како заклучок, лаказата од остриги NRC620, добиена под статички услови, покажа оптимална активност и стабилност во различни pH и температурни услови, демонстрирајќи супериорна стабилност во споредба со други извори на ензими. Додавањето на 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ ја зголеми активноста на ензимите за приближно 21% и 35%, соодветно. Кога се преработува во сок од јаболко, ензимот ја намалува pH вредноста и вискозитетот, додека содржината на феноли се намалува само малку за време на складирањето.
Резултатите го потврдуваат потенцијалот на лаказата во прехранбената индустрија, особено во бистрењето на пијалоци. Со специфично разградување на фенолните соединенија, лаказата не само што ја намалува заматеноста и ја подобрува бистрината, туку и го одржува квалитетот на овошните сокови под благи услови на работа. За разлика од традиционалните средства за бистрење како што се желатин, бентонит и силика гел, лаказата не создава отпад ниту отстранува пријатни ароми од пијалоците, што ја прави поеколошка и одржлива опција. Понатаму, во споредба со другите ензими и методи на филтрација, лаказата нуди целно и економично решение без да се загрози квалитетот на производот.
Кјомухимбо, ХД и Бринк, ХГ. Примени и стратегии за имобилизација на лакази што содржат бакар; преглед. Heliyon 9, e13156 (2023).
Време на објавување: 15 декември 2025 година